SNAP-tag^? 標(biāo)記技術(shù)問(wèn)題解答               

 細(xì)胞顯像和分析常見(jiàn)問(wèn)題解答

Q. 使用 SNAP-tag^? 標(biāo)記和 GFP 融合蛋白標(biāo)記有何不同？

A. GFP 和 SNAP-tag 都是在活細(xì)胞內(nèi)可視化蛋白的有效技術(shù)。GFP 是來(lái)源于 Aequorea victoria 的熒光蛋白，而SNAP-tag 來(lái)源于人 DNA 修復(fù)蛋白 hAGT。與 GFP 不同，欲熒光標(biāo)記與 SNAP-tag 相融合的蛋白，只需在培養(yǎng)基中直接加入各種熒光探針即可。更換不同熒光或者其它功能基團(tuán)（生物素、磁珠或阻斷劑）時(shí)，也無(wú)需重新克隆和表達(dá)，只要將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或重組蛋白與需要更換的底物孵育即可。

Q. SNAP- 和 CLIP-tag^? 有何不同？

A. SNAP-tag 和 CLIP-tag 均來(lái)源于人 DNA 修復(fù)蛋白 hAGT。SNAP-tag 識(shí)別 O⁶-標(biāo)記的芐基鳥(niǎo)嘌呤底物（benzylguanine）而 CLIP-tag 識(shí)別 O²-標(biāo)記的芐基胞嘧啶底物（benzylcytosine）。兩種tag均能將標(biāo)記物轉(zhuǎn)移到自身形成特異性的共價(jià)結(jié)合標(biāo)記。hAGT 經(jīng)基因工程改造后不再與 DNA 作用，而與芐基鳥(niǎo)嘌呤和芐基胞嘧啶的衍生物結(jié)合。兩種 Tag 之間無(wú)交叉反應(yīng)，因此可以在活細(xì)胞內(nèi)用不同熒光基團(tuán)同時(shí)標(biāo)記含 SNAP- 和 CLIP- 的融合蛋白。

Q. 蛋白質(zhì)能融合表達(dá)在 tag 的 N 端或 C 端嗎？

A. 能。SNAP- 和 CLIP-tag 都能融合表達(dá)在目的蛋白的 N 端或 C 端。但是，選用 ACP 或 MCPtag 標(biāo)記細(xì)胞外表面蛋白時(shí)，tag 的克隆方向必須是在細(xì)胞膜外的部分，這樣才能與相應(yīng)的底物進(jìn)行反應(yīng)。

Q. 底物對(duì)細(xì)胞有毒性嗎？

A. 在底物濃度高達(dá) 20 μM 時(shí)，細(xì)胞與底物孵育 2 小時(shí)，未見(jiàn)對(duì)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)有毒性作用。大多數(shù)底物在 20 μM 濃度下與細(xì)胞孵育 24 小時(shí)未見(jiàn)明顯毒性。

Q. 標(biāo)記蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性？

A. 標(biāo)記蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性取決于目的蛋白的穩(wěn)定性。標(biāo)記 SNAP-tag 的融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi) 2 天后仍然能被檢測(cè)到。

Q. SNAP-tag 的底物在固定過(guò)程中是否穩(wěn)定？

A. 穩(wěn)定。SNAP-tag 的底物熒光來(lái)源于有機(jī)熒光基團(tuán)，因此標(biāo)記的 SNAP-tag 融合蛋白在固定過(guò)程中表現(xiàn)非常穩(wěn)定，不會(huì)損失信號(hào)強(qiáng)度，這點(diǎn)與某些 GFP 發(fā)生光譜變異不同。SNAP-tag 融合蛋白標(biāo)記后，細(xì)胞用常用方法固定如：多聚甲醛、乙醇、甲醇以及甲醇/丙酮等，都不會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度。

Q. 體內(nèi)標(biāo)記 SNAP-tag 的推薦反應(yīng)條件？

A.SNAP-tag 標(biāo)記反應(yīng)可在多種緩沖液中進(jìn)行。選擇何種緩沖液取決于被融合蛋白的要求。下面是推薦的緩沖液選擇指南：pH 5.0-10.0，單價(jià)鹽（如 NaCl）50 mM-250 mM，以及至少 1 mM 的 DTT。如果需要可加入 0.5%v/v 的非離子型變性劑，但是應(yīng)絕對(duì)避免使用 SDS 和其它離子變性劑，因?yàn)樗鼈儠?huì)抑制 SNAP-tag 的活性。金屬離子螯合劑（如 EDTA 和 EGTA）同樣會(huì)抑制 SNAP-tag 的活性，因此也不能使用。