PCR 優(yōu)化的一般指導(dǎo)原則                

概述
NEB 針對(duì)基于 PCR 的應(yīng)用提供多種 DNA 聚合酶。在產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)或產(chǎn)品的網(wǎng)頁(yè)介紹上可以找到針對(duì)不同產(chǎn)品的特定優(yōu)化建議。下面的一般指導(dǎo)原則將幫助您的 PCR 實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

反應(yīng)建立指南

DNA 模板
? 盡可能使用高質(zhì)量、經(jīng)過(guò)純化的 DNA 模板。擴(kuò)增未純化的DNA 時(shí)（菌落 PCR 或直接 PCR），請(qǐng)參閱特定 的產(chǎn)品信息
? 對(duì)于低復(fù)雜度的模板（如質(zhì)粒、λ或BACDNA），每 50 μl 反應(yīng)體系加入 1 pg-10 ng DNA
? 對(duì)于高復(fù)雜度的模板（如基因組DNA），每 50 μl 反應(yīng)體系加入 1 ng-1 μg DNA
? DNA 濃度增高會(huì)降低擴(kuò)增特異性，尤其是循環(huán)次數(shù)較多時(shí)
 

引物
? 一般長(zhǎng)度為 20-40 個(gè)核苷酸
? 理想的 GC 含量為 40-60%
? 引物的 Tm 值可通過(guò) NEB 的 Tm Calculator 計(jì)算 (www.neb.com/TmCalculator)
? 退火溫度應(yīng)根據(jù)特定酶的推薦溫度設(shè)定。請(qǐng)注意 Q5? 和 Phusion?* 推薦的退火溫度是特別的
? 兩條引物間 Tm 差值應(yīng)在 5℃ 以內(nèi)
? 避免引物形成引物內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)卡結(jié)構(gòu)）以及引物二聚體
? 每條引物的終濃度應(yīng)為 0.05-1 μM。請(qǐng)參閱特定酶的詳細(xì)推薦信息
? 引物濃度過(guò)高可能導(dǎo)致非特異性引物結(jié)合，并產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物
? 當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小超過(guò) 20 kb 時(shí)，引物長(zhǎng)度應(yīng)≥ 24 個(gè)核苷酸，GC 含量應(yīng)在 50% 以上，Tm 值應(yīng)在 60℃ 以上
? 當(dāng)引入限制性位點(diǎn)時(shí)，需要在識(shí)別位點(diǎn) 5′ 端額外添加 6 個(gè)堿基
? 為了消除引物降解以及后續(xù)的非特異擴(kuò)增，可使用熱啟動(dòng)聚合酶（如 One Taq^? 熱啟動(dòng) DNA聚合酶或 Q5 熱啟動(dòng)超保真 DNA 聚合酶）

鎂離子濃度
? 對(duì)于大多數(shù) PCR 聚合酶，Mg²⁺ 最佳濃度通常為 1.5-2.0 mM
? NEB 提供的大多數(shù) PCR 緩沖液在 1 倍濃度下已含有足夠濃度的 Mg²⁺關(guān)于 Mg²⁺ 請(qǐng)參閱特定酶的產(chǎn)品信息
? NEB 提供多種不含 Mg²⁺ 的緩沖液,在需要嚴(yán)格控制 Mg²⁺ 濃度的實(shí)驗(yàn)中,可向其中補(bǔ)加 Mg²⁺
? 如果需要，可通過(guò)將 Mg²⁺ 濃度增加 0.2–1 mM來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化。在某些特定試驗(yàn)中，聚合酶可能需要高達(dá)6mM 的鎂離子
? Mg²⁺ 濃度過(guò)高可能導(dǎo)致出現(xiàn)非預(yù)期 PCR 產(chǎn)物
? Mg²⁺ 濃度過(guò)低可能導(dǎo)致反應(yīng)失敗
 

dNTPs
? 理想的 dNTP 濃度通常為每種 200 μM，但是某些聚合酶可能需要每種 dNTP 的濃度高達(dá) 400 μM。請(qǐng)參閱特定產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)獲取詳細(xì)的推薦信息
? 過(guò)量的 dNTP 會(huì)螯合 Mg²⁺ 并抑制聚合酶的活性
? dNTP 濃度過(guò)低可增加保真性，但會(huì)減少產(chǎn)量
? 當(dāng)使用古生菌 PCR 聚合酶時(shí)，引物、模板或dNTP 混合液中的尿嘧啶會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)失敗。針對(duì)這類反應(yīng)可使OneTaq 或 Taq DNA 聚合酶聚合酶濃度
? 反應(yīng)中的最佳聚合酶濃度因酶而異。請(qǐng)參閱特定產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)獲取詳細(xì)的推薦信息
? 一般而言，過(guò)量的聚合酶會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，特別是擴(kuò)增長(zhǎng)片段時(shí)
 

建立反應(yīng)
? 除非使用熱啟動(dòng)聚合酶（如 OneTaq 熱啟動(dòng)DNA 聚合酶或 Q5 熱啟動(dòng)超保真 DNA 聚合酶）否則需在冰上混合各種反應(yīng)組份
? 盡可能最后加入聚合酶
? 建立好反應(yīng)體系后立即放入已經(jīng)預(yù)熱至變性溫度的熱循環(huán)儀中。請(qǐng)注意在使用熱啟動(dòng)聚合酶（如 OneTaq 熱啟動(dòng) DNA 聚合酶或Q5 熱啟動(dòng)超保真 DNA 聚合酶）時(shí)無(wú)需預(yù)熱熱循環(huán)儀

循環(huán)條件指南

變性
? 最佳的變性溫度范圍為 94℃-98℃，并因酶而異。請(qǐng)參閱特定產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)獲取詳細(xì)的推薦信息
? 避免長(zhǎng)時(shí)間或高溫度溫育（除非模板富含 GC）
? 通常，熱循環(huán)過(guò)程中變性時(shí)間為 5-30 秒
? NEB 提供基于核酸適配子的熱啟動(dòng)聚合酶，無(wú)需額外變性步驟以激活聚合酶
 

退火
? 引物的 Tm 值可通過(guò) NEB 的 Tm Calculator 計(jì)算 (www.neb.com/TmCalculator)
? 除 Q5 超保真 DNA 聚合酶或 Phusion 超保真DNA 聚合酶*以外，退火溫度一般設(shè)定為比引物對(duì)的最低 Tm 值低 2℃-5℃
? 使用 Q5 超保真 DNA 聚合酶或 Phusion 超保真 DNA 聚合酶*時(shí)，退火溫度一般設(shè)定為比引物對(duì)的最低 Tm 值高 0℃-3℃。請(qǐng)參閱特定產(chǎn)品的參考文獻(xiàn)獲取詳細(xì)的推薦信息
? 通過(guò)優(yōu)化退火溫度或改用熱啟動(dòng) DNA 聚合酶（如 OneTaq 熱啟動(dòng) DNA 聚合酶或 Q5 熱啟動(dòng)超保真 DNA 聚合酶）可避免形成非特異產(chǎn)物
? 通過(guò)溫度梯度 PCR 可優(yōu)化退火溫度，將起始溫度設(shè)定為比引物對(duì)的最低 Tm 值低 5℃
? 理想狀態(tài)下，引物 Tm 值應(yīng)比延伸溫度低。但是，如果計(jì)算出的 Tm 值比延伸溫度高，可采用兩步法 PCR（將退火和延伸合并為一步）

延伸
? 推薦的延伸反應(yīng)溫度范圍為65℃-72℃，因酶而異。請(qǐng)參閱特定產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)獲取詳細(xì)的推薦信息
? 延伸速率因酶而異。一般而言，延伸速率范圍為15-60 s/kb。請(qǐng)參閱特定產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)獲取詳細(xì)的推薦信息
? 過(guò)長(zhǎng)的延伸時(shí)間會(huì)增加錯(cuò)配率，增加非特異擴(kuò)增和/或減少擴(kuò)增產(chǎn)量

PCR 問(wèn)題解決指南                

下面的指南可用于解決 PCR 反應(yīng)中出現(xiàn)的問(wèn)題。關(guān)于優(yōu)化反應(yīng)的更多建議可訪問(wèn) NEB 網(wǎng)站的技術(shù)參考部分。

內(nèi)切酶在 PCR 混合物中的活性              

通常，PCR 反應(yīng)后還要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切才能進(jìn)行下一步工作。為了方便起見(jiàn)，可以將內(nèi)切酶直接加到 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物中，而省略純化 PCR 產(chǎn)物的步驟。下表歸納了在 Taq、Phusion*、OneTaq 和 LongAmpTaq PCR 產(chǎn)物混合物中各種限制性內(nèi)切酶的酶切活性。50 μl 反應(yīng)體系中，將 5 單位內(nèi)切酶加入到 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物中，在適當(dāng)?shù)臏囟认路磻?yīng) 1 小時(shí)，凝膠電泳分析酶活性。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物中包括：1X ThermoPol 反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn) Taq 反應(yīng)緩沖液、Phusion HF 反應(yīng)緩沖液、OneTaq 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液或 LongAmpTaq 反應(yīng)緩沖液，含 dNTPs（終濃度為 200 μM）、1 μg DNA 和 1 單位 Taq DNA 聚合酶。

注意：聚合酶在切割 DNA 后仍然有活性，并能改變切割的 DNA 片段末端，對(duì)后續(xù)的連接反應(yīng)造成影響。含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的引物在酶消化過(guò)程中有競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。在非最佳條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)容易出現(xiàn)星號(hào)活性。如果遇到上述任何問(wèn)題，則需用乙醇沉淀，酚/氯仿抽提或離心柱純化 DNA。

圖例
使用 5 單位內(nèi)切酶切割 PCR 混合物：
+++ 表示完全切割                                              ++ 表示 ~ 50% 被切割
+ 表示 ~ 25% 被切割                                         - 表示未被切割

北京百靈克生物科技有限責(zé)任公司

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