美國(guó)Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技術(shù)作為新一代的RNA原位雜交技術(shù)，通過(guò)其專利的雙Z探針設(shè)計(jì)原理以及信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，可以兼容由于空氣中RNA酶對(duì)于RNA的部分降解導(dǎo)致一定程度的組織RNA缺損，從而達(dá)到對(duì)組織和細(xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行高效的原位檢測(cè)。

在使用RNAscope，Basescope以及miRNAscope對(duì)石蠟樣本，新鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進(jìn)行原位雜交的過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到各種各樣的技術(shù)問(wèn)題。本專題就一系列典型代表性的問(wèn)題進(jìn)行歸類總結(jié)。本篇聚焦樣本制備步驟，給大家提供一些相關(guān)小貼士。

對(duì)于RNAscope類實(shí)驗(yàn)的樣本制備，說(shuō)明書(shū)里有比較詳細(xì)的說(shuō)明。需要注意的事項(xiàng)有以下一些：

石蠟樣本的制備中，在冰上取材后建議第一時(shí)間放入10%中性福爾馬林固定液（10%NBF）浸泡16-32小時(shí)。固定液的體積建議至少是組織體積的10-20倍。充分固定組織樣本是RNA原位檢測(cè)的成敗關(guān)鍵之一。經(jīng)過(guò)充分固定的組織樣本內(nèi)的RNA可以與蛋白進(jìn)行交聯(lián)。從而達(dá)到最佳的保護(hù)效果。

對(duì)于新鮮冰凍樣本制備，需要提前準(zhǔn)備好冰凍包埋模具（如下圖）以及倒入模具備用的OCT，以及盛有干冰的盒子或者-80℃冰箱。在組織取材時(shí)，在冰上將組織剝離后，切成適當(dāng)大小后浸入預(yù)先倒入OCT的包埋模具中，之后快速將含有組織塊和OCT包埋模具放入裝有干冰的封閉盒子內(nèi)或者直接放入-80℃冰箱。每個(gè)包埋模具浸入組織后第一時(shí)間放入干冰或者-80℃內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。不建議積攢一批后再進(jìn)行后續(xù)操作。組織樣本要在干冰或者-80℃冰箱內(nèi)至少過(guò)夜保存后再進(jìn)行切片處理。

對(duì)于灌注固定的樣本，建議客戶使用新鮮配制的4%多聚甲醛（4%PFA）對(duì)動(dòng)物進(jìn)行灌注固定。組織取材后繼續(xù)放入新鮮的4%多聚甲醛（4% PFA）在4℃進(jìn)行固定24小時(shí)。之后依次浸入15%和30%的蔗糖溶液中（4℃）至樣本沉入底部（依據(jù)樣本大小不同時(shí)間不同）。此步可以保護(hù)組織細(xì)胞形態(tài)。之后將組織塊浸入裝有OCT的組織包埋盒內(nèi)，放入-80℃冰箱至少過(guò)夜后在進(jìn)行切片制備。此步有一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)即4%多聚甲醛的有效性問(wèn)題。由于多聚甲醛屬于強(qiáng)還原性試劑，故不像10%中性福爾馬林固定液那樣可以在室溫長(zhǎng)期保存。4%PFA會(huì)隨著時(shí)間發(fā)生氧化，從而固定效果大打折扣。為了最大程度的維持4%PFA的固定效果，建議使用新鮮配制（當(dāng)天配置）的4%PFA進(jìn)行固定。如果當(dāng)日不方便配置，可以事先配置好4%PFA，分裝并直接凍在-20℃，使用前拿出一只融化后立即使用。

一般依據(jù)以上提示制備的組織石蠟塊或者冰凍組織塊，進(jìn)行后續(xù)常規(guī)切片并相應(yīng)的RNAscope, Basescope或者miRNAscope檢測(cè)，組織樣本可以通過(guò)質(zhì)控（QC）檢測(cè)，即陽(yáng)性對(duì)照探針檢測(cè)評(píng)分≧2，陰性對(duì)照為0。值得注意的是，石蠟塊相較于冰凍組織塊，可以更為長(zhǎng)期的保存。經(jīng)驗(yàn)證經(jīng)過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)化固定5-10年的石蠟塊在進(jìn)行了石蠟切片后仍然可以通過(guò)RNAscope質(zhì)控檢測(cè)，并進(jìn)行靶探針檢測(cè)。值得注意的事，石蠟切片一旦切出來(lái)后，需要在2個(gè)月內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

除了常規(guī)組織樣本外，有研究團(tuán)隊(duì)使用到1）微小組織樣本，例如類器官，3D培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)或者小型昆蟲(chóng)等樣本；2）骨骼組織或軟骨樣本；3）血液樣本進(jìn)行RNAscope檢測(cè)，這幾類樣本同樣可以制備成石蠟塊，并進(jìn)行RNAscope檢測(cè)。針對(duì)于這類樣本的石蠟塊制備流程，本公眾號(hào)之前的有相關(guān)樣本制備的軟文參考。骨骼樣本固定， 脫鈣及制備方法請(qǐng)參見(jiàn)題目為：RNA原位檢測(cè)中，骨和軟骨樣本制備處理技術(shù)淺談及應(yīng)用；微小樣本制備請(qǐng)參見(jiàn)1）題目為：RNAscope技術(shù)在類器官中的應(yīng)用舉例以及類器官石蠟樣本制備簡(jiǎn)介；以及2）題目為：在談RNAscope技術(shù)與類器官的相關(guān)文章。更多類型樣本制備，例如血液樣本制備等問(wèn)題可直接與我公司FAS團(tuán)隊(duì)或者通過(guò)本公眾號(hào)聯(lián)系詢問(wèn)。

RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來(lái)的生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)長(zhǎng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)原理，可以高效敏感地檢測(cè)到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢(shì)如下：

應(yīng)用廣泛 

使用RNAscope技術(shù)，靶點(diǎn)RNA為大于等于300個(gè)堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測(cè)。

特異性強(qiáng)

RNAscope獨(dú)特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計(jì)有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時(shí)降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點(diǎn)的單個(gè)的Z 探針不會(huì)產(chǎn)生完整的信號(hào)放大分子結(jié)合位點(diǎn)，并會(huì)在雜交過(guò)程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號(hào)的放大，使得探針的信號(hào)具有高度特異性。探針設(shè)計(jì)合成需要2~4周時(shí)間即可完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測(cè)每個(gè)RNA 分子時(shí)，只需三對(duì)雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號(hào)的可視化。

單分子可視化和單細(xì)胞定量

使用RNAscope技術(shù)雜交上三對(duì)及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點(diǎn)狀信號(hào)。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對(duì)雙Z探針即可檢測(cè)到目標(biāo)RNA，而通常針對(duì)靶點(diǎn)RNA設(shè)計(jì)的探針為20對(duì)雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測(cè)到靶點(diǎn)RNA。

檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致性

RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測(cè)試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對(duì)不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實(shí)驗(yàn)操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測(cè)結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動(dòng)平臺(tái)上運(yùn)行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。

多通道多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)

由于RNAscope技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多通道探針雜交以及信號(hào)放大，故在可見(jiàn)光檢測(cè)中可以在同一張切片上同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)靶點(diǎn)；而在熒光檢測(cè)過(guò)程中，可以在同一張切片上檢測(cè)三個(gè)或三個(gè)以上靶點(diǎn)RNA。