1.限制性內切酶實驗問題指南

2.高保真限制性內切酶常見問題解答

Q. 為什么 HF 內切酶推薦使用的緩沖液與野生型的內切酶不同？

A. 在許多情況下，突變導致高保真內切酶的最適緩沖液發(fā)生變化。比如，野生型 SalI 酶的最適緩沖液 NEBuffer 3.1 是高離子強度緩沖液，然而 SalI-HF^? 的最適緩沖液為中等離子強度的 NEBuffer 2.1 和 CutSmart。

Q. 使用 CutSmart 緩沖液有什么優(yōu)勢嗎？

A. 是的，超過 200 種限制性內切酶（包括高保真限制性內切酶）在 CutSmart 緩沖液中有活性。當建立雙酶切
反應時有很大優(yōu)勢。 

3.轉化反應問題解決指南                

下面的指南可用于解決轉化過程中所出現(xiàn)的問題。

無菌落或液體培養(yǎng)基中無細菌生長
? 即使 T7 表達為嚴格調控型，但是 T7 表達宿主菌中也可能存在低水平的基礎表達。如果表達的蛋白可能有毒
  性，表達質粒的轉化應使用下列系統(tǒng)：
? I^q 菌株中過量表達的 LacI^q 抑制物能夠降低 T7 RNA 聚合酶的基礎表達。
? 在 lysY 菌株中，突變的 T7 溶解酶與 T7RNA 聚合酶相結合，從而減少目的蛋白的基礎表達。誘導后，新合
  成的 T7 RNA 聚合酶抵消了溶解酶作用，目的蛋白得到表達。
? 30℃ 或室溫培養(yǎng)也可減輕毒性問題。
? 檢查抗生素濃度（用對照質粒檢測）。、

電泳無蛋白或無蛋白活性
? 檢查毒性—細胞可能刪除或缺失了表達質粒的元件。如果有毒性表達問題，試用I^q和/或 lysY 宿主以減少基礎
  表達。
? 培養(yǎng)用于誘導蛋白表達的細胞。誘導前，將樣品平行涂布于有抗生素和無抗生素選擇標記的平板。如果有毒性
  產(chǎn)生，則兩個平板菌落數(shù)會有顯著的不同。在含抗生素的平板上，菌落生長數(shù)量極少（表明質粒丟失了）。

誘導蛋白不可溶

T7 表達蛋白經(jīng)常產(chǎn)量非常高，導致目的蛋白不可溶，解決方案如下：
? 低溫誘導（低溫 12-15℃ 過夜）
? 降低 IPTG 濃度至 0.01 mM-0.1 mM
? 縮短誘導時間（可以縮短至 15 分鐘）
? 細胞生長早期開始誘導（OD₆₀₀ = 0.3 或 0.4）