基于模塊化設計的 DNA 高通量組裝助力合成生物學研究

合成生物學是一門交叉學科，未來很有可能對學術和工業(yè)方面的應用產(chǎn)生重大的影響，包括生產(chǎn)新型治療藥物和疫苗、植物科學和生物燃料。其中許多學科都需要利用基于生物學的化工生產(chǎn)能力，將工程學原理應用于生物學。其重點通常是從天然生物系統(tǒng)中產(chǎn)生、表征和分離某些天然物質（如 DNA），并將其用作工程化生物路徑的組件。合成生物學的特點是將理性原則應用于這些生物組件的設計和組裝，但即便是理性設計，引入外源 DNA 到細胞中的影響也很難預測，這就需要測試多種排列組合以獲得期望的結果。加強對 DNA 片段的模塊化設計，就可以通過替換單個組件的方式來實現(xiàn)多樣化的潛在的組裝構建。DNA 片段的模塊化設計和組裝不僅可以簡化整體的 DNA 構建工作流程，還使自動化組裝成為可能，減少完成多次構建所需的時間、人力和成本，從而提高通量，并縮短總體開發(fā)周期。

NEBuilder^? 高保真 DNA 組裝和 NEBridge^? Golden Gate 組裝引領著下一代克隆技術。這兩種方法都兼容高通量工作流程，并已經(jīng)成功通過自動化平臺（例如 Labcyte^?, Inc. 的 Echo^? 525 液體處理系統(tǒng)和 SPT Labtech 的mosquito^? LV 移液工作站）實現(xiàn)了高通量無縫克隆。

無縫組裝結合 Labcyte^?, Inc. 的 Echo^? 525 液體處理系統(tǒng)

使用納升級聲波移液系統(tǒng)實現(xiàn) PIK3CA 的模塊化 DNA 組裝

在此研究中，NEBuilder^? HiFi 與 25 nL 移液量的 Labcyte Echo^? 525 液體處理系統(tǒng)結合使用，來完成基于五個模塊化片段，可以編碼 PIK3CA 癌基因的組裝構建。將這些模塊設計為分別包含發(fā)生于野生型 PIK3CA 上的四個活化突變：R38H、E542K、E545K 和 H1047R，將其克隆到 pcDNA?3.1/Zeo(+) 載體上，組裝成 8,940 bp 大小的質粒。本實驗的目標是利用 Echo 525 液體處理系統(tǒng)，在納升級別上完成五組五個片段的模塊化 DNA 組裝。該實驗通過 junction 菌落 qPCR 快速分析驗證是否組裝成功，并通過 Illumina^? MiSeq^? 測序進行核苷酸水平上的驗證。

微型化多片段 DNA 組裝

在此應用案例描述的研究中，NEB NEBuilder^? 高保真 DNA 組裝克隆試劑盒與 Labcyte^? Echo? 525 液體處理系統(tǒng)結合使用，基于五個模塊化片段進行 DNA 組裝構建。反應體積可以縮小到說明書推薦體積的 1/40，從而顯著節(jié)省試劑成本。在轉化到大腸桿菌之中后，首先通過 junction 菌落 qPCR 檢查組裝構建是否成功，然后，采用微型化的 Illumina^? MiSeq^? Nextera XT 方案進行測序驗證，從而進一步節(jié)省成本。

利用 Labcyte^? Echo^? 525 液體處理系統(tǒng)和 NEBuilder 高保真克隆試劑盒進行納升級DNA 組裝

在該實驗中，將 NEBuilder^? 高保真組裝試劑盒與 25 nL 移液量的 Labcyte^? Echo^? 525 液體處理系統(tǒng)相結合使用。通過組裝構建兩種獨特的質粒，展示了基于合理設計的模塊化合成生物學的優(yōu)勢。第一種組裝包含兩個片段，設計構建可以表達 LacZ 通路的 5223 bp 大小的質粒，并在轉化到非 α 互補的菌株中時，能夠進行藍白斑篩選。第二種組裝由五個片段構建 8,940 bp 大小的質粒，更接近典型工業(yè) DNA 生產(chǎn)的復雜性和大小。兩片段組裝成功從 20 μL 推薦體積縮小到 100 nL，試劑用量只有原來的 1/200。對于更復雜的組裝，反應體積成功降至原來的 1/80，而降至 1/40 時可以得到最穩(wěn)健的結果。當反應體積減小到 1/40 時，總反應體積為 500 nL，每種 DNA 片段只需要 1.25 fmoles 的加入量。這些實驗的目標是利用 Echo 525 液體處理系統(tǒng)，通過微量反應體積，完成兩個片段和五個片段的組裝構建。通過 junction qPCR 快速分析驗證組裝是否成功，并通過 Sanger 測序在核苷酸水平上進行驗證。

無縫組裝結合 SPT Labtech 的 mosquito^? LV 移液工作站

基于自動化高密度樣本存儲與微型化液體處理系統(tǒng)的高通量合成生物學組裝構建

本應用案例描述了一種自動化、高通量的工作流程，該工作流程已由 GeneMill 合成生物學服務中心（由 James Johnson 博士領導，位于利物浦大學）集成用于構建合成 DNA。

通過將 arktic 自動化樣本管理系統(tǒng)與 mosquito X1/LV 小體積液體處理系統(tǒng)相結合，可以簡化和加速 GeneMill 現(xiàn)有的手動工作流程。這拓展了該核心機構的 DNA 合成能力，有助于合成生物學研究人員獲得更多經(jīng)過驗證的實驗工具。