隨著 2019-nCoV 冠狀病毒疫情的日益嚴(yán)峻，人們對(duì)這一新型冠狀病毒也在進(jìn)一步了解中，目前已經(jīng)確認(rèn) 2019-nCoV 病毒的序列，也了解到該病毒與 SARS 病毒感染機(jī)制相同，都是通過人細(xì)胞的 ACE2 蛋白結(jié)合，從而引發(fā)感染。

而這一病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)之后的一些列生物學(xué)反應(yīng)，對(duì)人體其他組織器官的易感性，乃至治療方法的選擇都有待進(jìn)一步研究。

作為新一代 RNA 原位雜交技術(shù)，美國 Bio-Techne 旗下 ACD 公司的 RNAscope 技術(shù)的一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)就是可以在沒有可用抗體或者高效抗體的前題下，對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行 RNA 水平的原位檢測(cè)，包括定位和定量研究。目前 ACD 公司已經(jīng)針對(duì)此次 2019-nCoV 病毒的序列設(shè)計(jì)出探針，配合使用 ACD 公司的預(yù)處理和檢測(cè)試劑盒，可以對(duì)于該病毒進(jìn)行體內(nèi)原位檢測(cè)。

不僅于此，由于 RNAscope 探針設(shè)計(jì)的可選擇性，除了目前已經(jīng)設(shè)計(jì)出的探針外，客戶也可以根據(jù)自己需要，指定感興趣的病毒序列區(qū)域要求探針設(shè)計(jì)，以滿足不同的研發(fā)需要。

事實(shí)上，RNAscope 技術(shù)作為病毒生物學(xué)研究的利器，在過去的若干年內(nèi)一直被病毒研究界廣泛使用。該技術(shù)在 DNA 病毒，RNA 病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒的諸多病毒研究領(lǐng)域均貢獻(xiàn)了大量原位信息。尤其可以提供病毒在不同組織器官中的具體 1）細(xì)胞類型的定位，2）疫苗效果的評(píng)估，3）動(dòng)物模型建立后的驗(yàn)證，4）感染機(jī)體的免疫反應(yīng)等。

在病毒定位研究中，2015 年巴西寨卡病毒（Zika）爆發(fā)時(shí)，華盛頓醫(yī)科大學(xué) Jonathan J. Miner 為首的研究團(tuán)隊(duì)即通過 RNAscope 方法檢測(cè)到寨卡病毒在視網(wǎng)膜，視神經(jīng)和角膜中的分布，直觀給出了該病毒在眼內(nèi)的分布圖（見下圖，病毒陽性信號(hào)為圖中的棕色信號(hào)點(diǎn)）^[1]。

在對(duì)寨卡（Zika）病毒疫苗的研究中，美國 Vanderbilt University 的 Gopal 研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)人的單克隆抗體 ZIKV-117 可以有效減低小鼠感染 Zika 后組織的病理特點(diǎn)，并通過 RNAscope 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了注射安慰劑，同型對(duì)照小鼠抗體以及 ZIKV-117 抗體的懷孕小鼠胎盤內(nèi)病毒的分布和數(shù)量，從而證實(shí)了疫苗的效果（見下圖，病毒為圖中的棕色信號(hào)點(diǎn)）^[2]。

中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）是又一種近年來高致病性的冠狀病毒。在對(duì)該病毒疫苗的研發(fā)過程中，Haaqmans BL 研究團(tuán)隊(duì)通過 RNAscope 技術(shù)檢測(cè)了注射疫苗的效果，發(fā)現(xiàn)駱駝鼻粘膜內(nèi)，病毒顆粒在疫苗注射組相較于對(duì)照組有顯著下調(diào)（見下圖，RNAscope 陽性信號(hào)為 A 圖，B 圖和 C 圖中 ISH 中的紅色信號(hào)點(diǎn)）^[3]。

在病毒感染動(dòng)物模型的建立和驗(yàn)證中，Drexler JF 團(tuán)隊(duì)通過 RNAscope 的方法，檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞內(nèi) HCV 病毒的存在和分布狀況，確認(rèn) HCV 病毒感染動(dòng)物模型建立成功（下圖中的紅色信號(hào)點(diǎn)）^[4]。

相同的 RNAscope 應(yīng)用實(shí)例也被報(bào)道在漢他病毒（Sin Nombre/Hantavirus，SNV）感染病毒動(dòng)物模型中。RNAscope 結(jié)果確認(rèn)漢塔病毒存在于恒河猴肺臟上皮細(xì)胞內(nèi)（下圖中棕色信號(hào)點(diǎn)）^[5]。

在病毒入侵感染動(dòng)物或人之后，免疫系統(tǒng)對(duì)于病毒的應(yīng)激反應(yīng)隨著病毒的差異而不同。例如在塞尼卡谷病毒（Seneca Valley Virus，SVV）感染恒河猴體內(nèi)，人們發(fā)現(xiàn)該病毒誘導(dǎo)短暫的 CD8 陽性 T 細(xì)胞在恒河猴的神經(jīng)節(jié)浸潤。

RNAscope 檢測(cè)結(jié)果顯示感染過 SVV 之后，伴隨著 CD8 陽性 T 細(xì)胞的聚集，同一區(qū)域表達(dá) CXCL10 細(xì)胞趨化因子，提示 T 細(xì)胞的聚集是由 CXCL10 因子誘導(dǎo)引發(fā)的^[4]。

如下圖所示，RNAscope ISH 對(duì)應(yīng)的紅色信號(hào)點(diǎn)為 CXCL10 的 mRNA 信號(hào)。在這里，由于趨化因子本身為分泌型蛋白，免疫組化的方法很難進(jìn)行組織學(xué)定位，而 RNAscope 方法可以很好地解決這個(gè)問題^[6]。

RNAscope 技術(shù)

RNAscope 技術(shù)是由 Bio-Techne 旗下 Advanced Cell Diagnostics (ACD) 公司研發(fā)的 RNA 原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。

與傳統(tǒng)的 RNA 原位雜交相比，RNAscope 技術(shù)屬于新一代 RNA 原位雜交技術(shù)，其特異性的雙 Z 探針設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)長鏈 RNA 探針的弊端，配以自身級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)原理，可以高效敏感地檢測(cè)到目標(biāo) RNA。

該方法的具體優(yōu)勢(shì)如下：

1. 應(yīng)用廣泛: 使用 RNAscope 技術(shù)，靶點(diǎn) RNA 為大于等于 300 個(gè)堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。因而 RNAscope 技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測(cè)。

2. 特異性強(qiáng)：RNAscope 獨(dú)特的雙 Z（ZZ）探針設(shè)計(jì)有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時(shí)降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點(diǎn)的單個(gè)的 Z 探針不會(huì)產(chǎn)生完整的信號(hào)放大分子結(jié)合位點(diǎn)，并會(huì)在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號(hào)的放大，使得探針的信號(hào)具有高度特異性。探針設(shè)計(jì)合成需要 2～4 周時(shí)間即可完成。

3. 靈敏度高：RNAscope 方法檢測(cè)每個(gè) RNA 分子時(shí)，只需三對(duì)雙 Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號(hào)的可視化。

4. 單分子可視化和單細(xì)胞定量: 使用 RNAscope 技術(shù)雜交上三對(duì)及以上雙 Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點(diǎn)狀信號(hào)。ACD 公司提供的分析軟件更可以定量每一個(gè)單細(xì)胞內(nèi) RNA 的表達(dá)水平。

5. 兼容降解的 RNA: 由于 RNAscope 三對(duì)雙 Z 探針即可檢測(cè)到目標(biāo) RNA，而通常針對(duì)靶點(diǎn) RNA 設(shè)計(jì)的探針為 20 對(duì)雙 Z 探針，因而即使目標(biāo) RNA 發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測(cè)到靶點(diǎn) RNA。

6. 檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致性：RNAscope 技術(shù)用到的探針以及所有檢測(cè)試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對(duì)不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實(shí)驗(yàn)操作流程，故使得 RNAscope 技術(shù)檢測(cè)結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在 Leica 以及羅氏 Ventana 自動(dòng)平臺(tái)上運(yùn)行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。

7. 多通道多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)：由于 RNAscope 技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多通道探針雜交以及信號(hào)放大，故在可見光檢測(cè)中可以在同一張切片上同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)靶點(diǎn)；而在熒光檢測(cè)過程中，可以在同一張切片上檢測(cè)三個(gè)或三個(gè)以上靶點(diǎn) RNA。

References:

1. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell Rep 2016, 16(12):3208-3218;

2. Neutralizing human antibodies prevent Zika virus replication and fetal disease in mice. Nature 2016, 540(7633):443-447;

3. An orthopoxvirus-based vaccine reduces virus excretion after MERS-CoV infection in dromedary camels. Science 2016, 35(6268):77-81;

4. Evidence for novel hepaciviruses in rodents. PLoS Pathog 2013, 9(6): e100343;

5. Pathophysiology of hantavirus pulmonary syndrome in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A 2014, 111(19);

6. T-cell infiltration correlates with CXCL10 expression in ganglia of cynomolgus macaques with reactivated simian varicella virus. J Virol 2013, 87(5):2979-2982.